背景介绍
急性胰腺炎（AP）是最常见的胃肠道疾病之一，需要急性住院治疗，年发病率为34/。AP以局部和全身炎症反应为特征，根据年修订的亚特兰大分类，AP分为轻度AP（MAP）、中度AP（MSAP）和重度AP（SAP）。AP的总体死亡率为1~3%，但SAP患者的死亡率高达30%。胆结石（45%）仍然是AP的主要原因，其次是酗酒（20%）。Speck于年首次报道了高甘油三酯血症与AP之间的病因学联系。然而，随着经济的快速增长和饮食结构的改变，高甘油三酯血症相关急性胰腺炎（HTGAP）的发病率在世界范围内不断增加。HTGAP的病理生理机制在很大程度上尚不清楚，但动物研究表明，游离脂肪酸的积累和炎症反应的过度激活可能是该疾病发病的原因。越来越多的证据表明，HTGAP比非HTGAP的严重程度更高，包括感染性坏死、器官衰竭、ICU入院、住院时间更长和死亡的风险更高。目前对HTGAP的治疗包括器官功能障碍的支持治疗、液体复苏、疼痛控制、营养支持、胰岛素输注、抗高甘油三酯血症药物、肝素、血液滤过和血浆置换。然而，没有适用于HTGAP的标准管理模式或指南。近年来研究表明，肠道菌群的变化与AP的进展密切相关。例如，与健康对照组相比，AP患者潜在致病菌（如肠杆菌科和肠球菌）的相对丰度较高，有益细菌（如双歧杆菌）的相对丰度较低。多种因素导致AP的进展和恶化，包括细菌成分的不平衡、短链脂肪酸（SCFA）产量的减少、肠粘膜屏障功能的破坏以及肠道细菌的易位。我们之前的研究显示，不同严重程度的AP患者的肠道微生物群组成和功能不同。Yun等人报道，高甘油三酯血症与肠道微生物群多样性降低有关，这可能是调节血脂的一个重要目标。最近的一项系统评价显示，使用益生元/益生菌/合生元治疗的SAP患者发生器官衰竭的风险较低，住院时间较短。然而，肠道微生物群与HTGAP预后之间的联系尚不清楚。因此，研究HTGAP患者肠道菌群改变的致病作用丰富了我们对AP的认识，并提供了改善当前治疗的机会。本研究旨在探讨HTGAP患者肠道菌群变化与预后的关系，为今后的研究和转化奠定基础。2.材料和方法
2.1.研究人群
这是一项单中心、前瞻性、观察性队列研究。年6月至年4月，我医院登记了AP患者。本研究采用分层随机抽样方法从我们的数据库中选择患者。纳入标准包括根据年修订的亚特兰大标准诊断AP。患者必须在发病后24小时内住院。主要排除标准为慢性胰腺炎、免疫抑制性疾病、炎症性肠病、癌症、肠易激综合征、胃肠炎、消化性小肠结肠炎，以及在入组后使用抗生素、益生菌、泻药或两个月内使用中药。获得所有参与者的知情同意。获得PUMCH道德委员会的道德批准（标识符：JS，批准日期：年2月20日。有效期：年2月至年8月）。2.2.人口统计和临床数据
我们回顾了患者的电子病历，以获得人口统计学和临床数据，包括年龄、性别、身高、体重、合并疾病、实验室数据、影像学检查、疾病严重程度、并发症和临床结果。HTGAP定义为血清甘油三酯mg/dL，排除AP的其他病因。根据年修订的亚特兰大分类，AP分为MAP、MSAP和SAP。还获得了急性生理学和慢性健康评估II（APACHEII）、序贯器官衰竭评估（SOFA）评分和Balthazar评分，以评估疾病的严重程度。局部和系统并发症的定义基于先前的研究。局部并发症包括急性胰周积液（APFC）、胰腺假性囊肿、急性坏死性积液（ANC）、包裹性坏死（WON）和感染性坏死。APFC被定义为具有均质液化成分且无明确壁的胰腺周围液体收集。胰腺假性囊肿是一种囊性积液，具有明确的炎性壁，通常位于胰腺外，坏死很少或没有坏死。ANC是一个包含与坏死性胰腺炎相关的液体和坏死量可变的集合。WON是一种成熟的胰腺和/或胰周坏死囊性集合，形成了明确的炎性壁。感染性坏死被定义为胰腺或胰周坏死的阳性培养物，通过细针抽吸（FNA）或对比增强CT上液体收集中存在气体。系统并发症包括急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、全身炎症反应综合征（SIRS）、急性肾损伤（AKI）、腹腔间隔室综合征（ACS）、肝损伤、心肌损伤、精神状态改变、败血症、休克和肠梗阻。ARDS被定义为呼吸功能障碍，其特征为急性发作、胸部X线摄片上的双侧阴影和PaO2/FiO2≤，呼气末压力或持续气道正压≥5cmH2O。如果符合以下两个标准，则诊断为SIRS：呼吸频率20次呼吸/分钟，心率90次跳动/分钟，白细胞计数个细胞/μL或个细胞/μL，体温38或36?如果符合以下两个标准，则诊断为AKI:血肌酐≥0.3毫克/分升(≥26.5mmol/L），或在48小时内，血清肌酐增加至≥在前7天内为基线的1.5倍，6小时内尿量0.5mL/kg/小时。ACS被定义为持续的腹内压20mmHg（有或没有腹内灌注压60mmHg），与新的器官功能障碍相关。肝损伤的定义是丙氨酸或天冬氨酸转氨酶水平高于正常上限。心肌损伤定义为心肌肌钙蛋白浓度高于正常上限。精神状态的改变被定义为谵妄或停止镇静后延迟觉醒。脓*症被定义为SIRS，具有经证实或怀疑的感染源。休克被定义为收缩压≤90mmHg。根据以下标准诊断肠梗阻：平片或腹部CT显示肠梗阻，患者出现腹痛、呕吐、腹胀，24小时以上无气体和粪便。临床结果包括器官衰竭、ICU住院时间、住院时间和死亡率。2.3.样本采集、DNA提取和16SrRNA基因测序
在入院的第一天，通过无菌直肠拭子收集粪便样本。之前的研究报告了样本采集的详细信息。采样过程中采用了以下步骤。首先，用无菌生理盐水湿润无菌干拭子的头部。其次，将湿润的拭子轻轻插入肛门约4-5cm，然后旋转数次，以收集直肠粘膜表面的微生物。第三，将拭子头切下并放入消*管中。第四，样品储存在实验室?80?C的冰箱。使用基于先前描述的方案的从粪便样本中提取微生物基因组DNA。提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测浓度和纯度。将适量的DNA样品置于无菌离心管中，然后用无菌水稀释至1ng/μL。16SrRNA的V3–V4区域通过聚合酶链反应（PCR）扩增，然后纯化，如先前研究所述。稀释后的DNA用作模板，PCR使用带有条形码的引物、Phusion?高保真PCR主混合物和GC缓冲液（美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室）以及高效高保真酶。如前所述，使用TruSeq?DNAPCR免费样品制备试剂盒制备了16SrRNA基因V3–V4区域的测序文库。纯化的扩增子在IlluminaMiSeq平台（IlluminaInc.，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）上汇集并测序。2.4.生物信息学分析
下游扩增子生物信息学分析基于EasyAmplicon（版本1.10）。软件包VSEARCH（版本2.7.1用于反复制。使用USEARCH（10.0版）中实现的unoise3算法将这些独特序列去噪为扩增子序列变体（ASV），并使用–USEARCH_全局函数生成ASV表。基于核糖体数据库项目（RDP）训练集v16，使用USEARCH的sintax算法实现了ASV的分类分类。2.5.统计分析
使用R软件（版本4.0.3）分析微生物多样性。阿尔法多样性分析包括丰富度和香农指数，这是由纯素套餐（版本2.5-7）完成的。基于微生物群落的加权UniFrac距离，通过主坐标分析（PCoA）计算β多样性。分别采用火鸡显著性差异（HSD）检验和阿多尼斯检验分析各组之间α和β多样性的显著性差异。多样性分析和稀疏曲线的结果通过ggplot2软件包可视化，并使用Vendiagram软件包生成显示组间ASV重叠的Venn图。两组微生物群落的组成分别在门、科和属的水平上呈现为堆叠条形图。使用chord图来执行分类级别和使用Circrize包的不同组之间的关系。基于GGRAPHE软件包（版本2.0.4），实现了显示分类层次关系的映射树。一个曼哈顿图和一个火山图分别显示了通过R软件包在门水平上群体之间的ASV差异。edgeR软件包用于评估HTGAP组和非HTGAP组之间ASV丰度的差异，Benjamini–Hochberg方法用于控制错误发现率（FDR）。Bugbase和通过重建未观察状态对群落进行的系统发育研究（PICRUSt2）分别用于预测细菌群落的表型和功能途径。Kruskal–Wallis检验用于评估基于STAMP（2.1.3版）软件的各组间代谢途径的差异丰度，StoreyFDR[35]用于校正多重比较。变量之间的相关性，包括高甘油三酯血症、ASV、代谢途径、疾病严重程度和临床结果，使用Spearman非参数相关分析进行，然后使用pheatmap软件包（版本1.0.12）进行可视化。使用SPSS（25.0版）对两组患者的临床特征进行分析。数据以正态性连续变量的平均值±标准差（SD）表示，以异常分布连续变量的中位数（四分位间距[IQR]）表示，以分类变量的数量（百分比）表示。通过卡方检验或Fisher检验计算分类变量的P值。连续变量采用t检验或非参数Kruskal–Wallis检验。双侧P值小于0.05被认为具有统计学意义。
3.结果
3.1.临床特征
共有60名患者被纳入本研究，他们根据甘油三酯水平分为两组。表1显示了HTGAP组和非HTGAP组之间人口统计学和临床特征的比较。与非HTGAP组相比，HTGAP组患者更年轻（40.8±11.3vs.51.8±16.6；p=0.），体重指数（BMI）更高（27.6±3.7vs.24.7±2.3；p=0.），脂肪肝比例更高（86.7%vs.50.0%；p=0.）。此外，HTGAP组患者发生SAP的风险较高（46.7%对20.0%；p=0.），全身炎症反应综合征（SIRS）的发生率较高（63.3%对36.7%；p=0.），急性呼吸窘迫综合征（ARDS）（50.0%对23.3%；p=0.），器官衰竭（56.7%对30.0%；p=0.），ICU入院（53.3%对20.0%；p=0.），与非HTGAP组患者相比，住院时间更长（中位数18.0，IQR9.8-28.0对中位数6.5，IQR3.0-14.0；p=0.）。3.2.HTGAP患者的并发症影响肠道微生物组组成
收集了60份直肠拭子并发送测序。没有因为测序质量差丢弃任何样本。从样本中检测到次读取，并分配给个ASV。平均而言，每个样本有个ASV（范围68-）和个序列（范围-）（表S1）维恩图分析显示，在非HTGAP组和HTGAP组中分别观察到和个ASV，这两组共有40个ASV（图S1）。利用物种丰富度（图1a）和香农多样性指数（图1b）对阿尔法多样性进行评估。我们发现物种丰富度（p=0.）和香农多样性指数（p=0.）之间没有统计学意义的差异在HTGAP组和非HTGAP组之间，但HTGAP组的丰富度有降低的趋势。β多样性评估加权UniFrac距离的PCoA未显示HTGAP和非HTGAP之间微生物群落的显著差异（图1c）。物种丰富度的稀疏曲线（图1d）逐渐变平，这表明已采集了合理数量的个体样本。这两组在门水平上主要由厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门组成，与非HTGAP组相比，厚壁菌门在HTGAP组中更为常见，如图2a所示。在家系水平，HTGAP组中肠球菌科和梭菌属更丰富，而非HTAP组中Lachnospiraceae和杆菌科菌更丰富（图2B）。在属水平上，与非HTGAP组相比，HTGAP组的金*色葡萄球菌和肠球菌相对丰度较高，类杆菌相对丰度较低（图2c）。chord图（图S2）显示了微生物群组成和患者群体之间的联系，表明与非HTGAP组相比，HTGAP组的17株细菌中有8株丰度较高。图S3显示了肠道菌群的水平结构。
3.非HTAP和HTGAP患者的分类特征不同
根据edgeR分析，火山图（图3a）和热图（图3b）显示了55个ASV，HTGAP组和非HTGAP组的读取计数显著不同，其中HTGAP组与非HTGAP组相比，21个ASV耗尽，34个ASV富集。在门水平上，与HTGAP组相比，非HTGAP组的放线菌和类杆菌数量增加，而杆菌、梭状芽孢杆菌和Gammaproteobacteria数量减少（图3c）。
在物种水平上，HTGAP组具有较高的Peptoniphilusgorbachii（ASV）（0.%vs0.%，p=0.）和Peptoniphilusgorbachii（ASV）（0.%vs.%，p=0.）丰度，但与非HTGAP组相比，Dorealongicatena（ASV）（0.%对0.%，p=0.）、Dorealongicatena（ASV）（0.%对0.%，p=0.）、Dorealongicatena（ASV）（0.对。Bacteroidesovatus（ASV）（0.%对0.%，p=0.）和Bacteroidesxylanisolvens（ASV5）（0.对0.，p=0.）（图4）丰度较低。
3.4.HTGAP患者中微生物功能的改变
Bugbase分析用于探索HTGAP组和非HTGAP组之间细菌代谢表型的差异，氧化应激耐受性和可移动元素含量的预测分别如图5a、b所示。与非HTGAP组相比，HTGAP组含有可移动元素的细菌相对丰度略有增加，但无显著性差异。对于氧化应激，在HTGAP组中检测到具有耐受应激能力的细菌数量较低。为了分析肠道菌群的代谢功能途径，使用PICRUSt2，结果如图5c所示。Blautiawexlerae（ASV和ASV）、拟杆菌ovatus（ASV）和Dorealongicatena（ASV、ASV和ASV）与氨基酸代谢、次级代谢产物生物合成、核苷酸生物合成、NAD+激酶、谷氨酸合酶（NADPH/NADH）小链相关的微生物基因功能呈正相关，4-α-葡聚糖转移酶、甲酸盐C-乙酰转移酶和糖原磷酸化酶。3.5.临床指标与肠道微生物群之间的相关性
我们进行了Spearman相关分析，以探讨肠道菌群与疾病严重程度和临床结果等临床指标之间的关系，结果如图6所示。我们发现，属于肠杆菌科的大肠杆菌/志贺氏菌中的九种ASV与休克、ICU入院、ICU住院、急性坏死累积、Balthazar评分和壁化坏死呈中度至高度正相关。肠球菌科内的肠球菌与脓*症、感染、肝损害、ICU监护、ICU治疗时间、SOFA评分、器官衰竭、休克正相关，但与Peptoniphilusgorbachii中的Peptoniphilaceae呈负相关。感染坏死、意识障碍和死亡率与肠杆菌科中的大肠杆菌/志贺氏菌明显相关。高甘油三酯血症、心肌损伤和疾病严重程度与Akkermansiamuciniphila中的Verru