译者：医院生物治疗科丁永梅
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在过去的两个方面研究使得肿瘤治疗取得进展，带给了患者显著获益。一方面来源于对驱动肿瘤发展信号通路活化或失活的突变基因的深入研究，这方面的研究促进了靶向治疗的发展，靶向治疗对大部分拥有共同靶基因突变的肿瘤患者有效，虽然反应持续时间有限。另一方面是分子免疫领域的研究进展，揭示了调控细胞免疫反应机制的复杂性。这些方面的进展使免疫检测点成为良好的靶点，从而激活抗肿瘤T细胞的反应，达到持续长期有效，但这样的有效性仅存在一部分患者中。在这篇综述中讨论了在两个领域的进展并提出将其联合，同时越来越多资金投入到药物联合的研究中，希望治愈大部分肿瘤患者。
引言年，科学界联合抵抗共同的敌人——癌症，同年尼克松总统签署“向癌症开战”议案，此项议案为提高对癌症了解及治疗的科学研究提供资金。毫无疑问的，经过这些年的研究，阐明了调控正常细胞生长、死亡的分子机制，包括对信号途径如何在肿瘤发展过程中逐步失控的深刻理解。这些理解促使肿瘤治疗进入到基因靶向治疗和“精准医学”的时代。基因靶向治疗可带来显著地临床获益。由于肿瘤细胞基因组学的不稳定性和其他耐药机制，肿瘤对这些药物产生耐药性，最终导致大部分患者疾病进展。阐明肿瘤细胞对药物的耐药机制和研发新的靶向相关信号途径药物已成为肿瘤治疗方法逻辑上的指导。然而，由于肿瘤细胞基因学和表观遗传学的不稳定性，每种新的药物或靶向药物联合治疗将会面对更加复杂的获得性耐药机制。目前的研究结果表明T细胞，通过基因片段随机重组产生抗原受体，随后通过选择性加工形成巨大的T细胞克隆储备库，提供丰富的多样性和能力来识别肿瘤的复杂的抗原。对于T细胞反应调控的研究提供了重要的免疫检测点原理，这一原理已经成功运用于临床，并为一部分转移性黑色素瘤患者带来了持久有效和超过10年的长期生存，同时也为其他类型肿瘤治疗带来了希望。现在，通过联合基因靶向药物和免疫检测点治疗，我们最终达到肿瘤的治愈。为了支持这一目标和加速这一过程，要求在这方面的研究支持及资金投入有所改变。
精准医疗：靶向驱动基因在过去的三十多年中，关于肿瘤发展分子机制的研究取得了巨大的进展。现在我们清楚了肿瘤发展包括体细胞突变，体细胞突变导致参与正常调控细胞分化和程序性细胞死亡的基因活化，同时使参与保护DNA损伤或驱动凋亡的基因失活。由于这些基因学的关系，在最初与肿瘤的战争中开始了肿瘤基因组测序，提供全面的肿瘤体细胞突变图谱，使得识别治疗靶点成为可能。基础设备及基金被提供来协调测序工作。现在我们已经知道体细胞突变水平在不同肿瘤之间和内部是不同的，在成人白血病中的突变水平低，与致癌物相关肿瘤的突变水平高。
突变可以分为两种广泛的类型：在肿瘤发生中起主导作用的“驱动基因”突变和在肿瘤发生中无明显作用的“乘客基因”突变。癌症基因组图谱（TCGA）工程已经可以识别很多这些突变。这使得研发靶向和选择性干扰肿瘤信号途径的药物理有了论基础。这使得肿瘤治疗发生彻底性变革，从以往“一刀切”的肿瘤药物，例如传统化疗杀伤所有的分裂细胞，包括肿瘤增殖细胞或再生正常细胞，到如今更加个体化的治疗策略，特异性靶向药物治疗有特异分子突变的肿瘤。
BRAF抑制剂就是基因靶向治疗的例子，当人们发现40-60%的皮肤黑色素瘤携带可诱导MAPK通路持续性（组成性）激活的BRAF突变是，BRAF抑制剂就此用运而生。对比BRAF抑制剂（vemurafenib)和dacarbazine的随机III期临床试验，vemurafenib治疗组反应率为-48%，dacarbazine组反应率为5%。然而，中位反应持续时间仅有6.7个月。另一作为靶点的致癌通路是可导致融合癌基因EML4-ALK的络氨酸染色体重
EML4融合部分介导渐变性淋巴瘤激酶配体非依赖性寡二聚化和/或二聚化，导致持续性激酶活性，带有此融合基因的患者对标准化疗的反应率为10%（Hanna）。Crizotinib，一种靶向ALK的酪氨酸激酶抑制剂，在III期临床试验中的反应率为65%，中位反应持续时间少于8个月。虽然用crizotinib治疗的患者的PFS显著改善，但遗憾的是中期分析未见总生存期获益。所以，即使靶向“驱动突变”的想法有很多优点，且已证明临床有效，但实际上用这些药物治疗的患者获得短期的临床缓解时间，最终产生耐药机制而导致疾病进展和死亡。
获得性耐药的机制分为三大类：靶基因的改变（由于突变，扩增或选择性拼接）；不影响原靶基因但再激活相关通路的改变（例如BRAF突变的黑色素瘤中的NRAS和MEK突变）；激活其他通路的改变（如生长因子受体的激活）。我们付出巨大的努力提高基因靶向治疗的效果，其中包括同一信号通路的不同分子靶点制剂的研究，例如BRAF抑制剂和MEK抑制剂的联合治疗方案，这样的方案减少了代偿性反馈回路，同时抑制了由于下游通路突变所致的耐药。阻断平行通路预防耐药的产生是不同的策略。这些联合方案的主要挑战是耐药机制的多样性和由于肿瘤内异质性所致不同细胞中不同作用机制的事实。考虑到这些事实，很难想象到实际的方案来克服在肿瘤治疗过程中产生的多种耐药机制，肿瘤细胞的不断演变和逃脱靶向治疗的机制提出一个问题：基因靶向联合治疗策略是否可治愈肿瘤？
动员T细胞治疗肿瘤的优点随着对复杂的肿瘤生物学知识的了解，协调固有免疫和适应性免疫互相作用的基础细胞学和分子学机制也得到深入理解。简单地说，固有免疫系统主要由细胞因子、补体系统和吞噬血统如巨噬细胞，中性粒细胞，树突状细胞和自然杀伤细胞组成。固有免疫系统的细胞有识别感染微生物产物和死亡细胞的内在天然受体。巨噬细胞和中性粒细胞对微生物感染早期防御，而树突状细胞为适应性免疫系统提供一个关键的连接口，适应性免疫系统是由体细胞来源的B细胞和T细胞组成，其克隆性表达抗原受体库。
免疫控制基本原理的理解为发展积极免疫体统的参与肿瘤治疗的有效策略提供了合理的基础。T细胞活化抗肿瘤优于其他的肿瘤治疗方式势，这种抗肿瘤策略非常有前景。
首先是特异性，T细胞表达抗原受体来识别细胞表面的MHC分子复合物和细胞几乎所有的蛋白多肽，而不仅仅限于细胞表面分子的肽抗原。第二个特点是记忆性，如果抗原再次出现，长寿记忆T细胞加速二次反应的动力，从而激活初始T细胞反应。最后T细胞反应的适应性，T细胞不仅对肿瘤的异质性有作用，而且对于复发肿瘤的新抗原有反应。据计算，产生T细胞抗原受体的体细胞重组过程可产生多达不同的受体。在这一理论数值中，每人拥有大约不同的受体，这一巨大的受体库提示免疫体统本身就具有很好的武装能力来应对肿瘤的变异性和适应性。
利用肿瘤抗原特异性T细胞反应随着来源于肿瘤细胞MHC分子的肽的cDNA表达克隆方法和序列分析的出现，已经在人和鼠体内识别的肿瘤特异性T细胞所定义的肿瘤抗原被大量鉴定出。大部分的肿瘤抗原在不同患者的肿瘤细胞共有，并且可分为四类：致癌病*产物（一些白血病的Epstein-Barr病*，宫颈癌和一些头颈部肿瘤的人类乳头状病*）；组织特异性分化分子相关的抗原（黑色素瘤的酪氨酸激酶和相关蛋白和前列腺癌的前列腺酸性磷酸酶）；仅在胚胎发育期正常表达的分子（结肠癌中的癌胚抗原，肝癌的甲胎蛋白）；癌睾丸抗原，正常表达于配子发育期，但由于表观遗传学调控的改变，可在许多肿瘤细胞表达（MAGE和NY-ESO-1）。
另外，体细胞突变也可导致肿瘤特异性多肽的产生，这些多肽可以与主要组织相容性复合物（MHC）结合，作为新抗原被免疫系统识别。乳腺癌和肠癌肿瘤细胞的表位图的分析揭示了在结直肠癌和乳腺癌中分别有十分之七（70%）的突变基因可以单独和HLA-A*结合。由于每个杂合子携带6个不同的HLAI型基因，这就意味这平均42-60潜在的新抗原被提呈给T细胞。在这些预测的支持下，目前的研究已经证明在人和鼠肿瘤中由于体细胞突变产生的新抗原可被T细胞识别。
首先，由于先前对共有抗原识别的研究，肿瘤免疫治疗领域聚焦于研发治疗性疫苗，这些疫苗扩增T细胞来靶向肿瘤表达的共有抗原。许多研究重点于通过多肽、蛋白和整个肿瘤细胞刺激T细胞反应，这些刺激物包括经修饰而表达细胞因子、DNA、重组病*性疫苗的细胞，或者单独的抗原-树突状细胞或联合免疫制剂或细胞因子。虽然这些研究在当时是最好的科学研究，同时为免疫反应的激活可以为临床带来获益提供了证据，但大部分研究得到阴性结果，普遍没有获得客观临床反应。随着许多临床试验的失败，这方面的研究热情一定程度上在消退。
这些疫苗方面研究的失败可能有许多原因，包括抗原的选择，无足够的刺激，或肿瘤反应性T细胞的无能。一些T细胞外在抑制机制已经明确，如TGFβ，FoxP3+调节性T细胞（Treg），和可以抑制抗肿瘤反应的色氨酸代谢产物（IDO），临床前和临床研究正在努力减弱这些抑制机制的影响。
T细胞活化复杂性的阐明另一个早期肿瘤疫苗试验失败的原因可能是对调节T细胞活性的细胞内通路复杂性理解不够。到上世纪80年代末，我们知道了通过抗原受体，多肽/MHC复合物简单结合不足以活化T细胞，同时可以使T细胞无能。为了使T细胞完全激活，必须结合经抗原提呈细胞如树突状细胞提呈的抗原，同时需要B7分子（B7-1和B7-2）与其配体，T细胞表达的CD28，结合的共刺激分子信号。所以，当T细胞最初遇到肿瘤细胞时，T细胞特异性并不会被激活，甚至可能导致无能，因为除了一些淋巴瘤外，肿瘤不表达共刺激分子B7。故T细胞未被激活时对肿瘤细胞是视而不见的，只有通过提呈死亡肿瘤细胞抗原的树突状细胞交叉启动激活T细胞。同时对抗原/MHC复合物和共刺激分子配体的识别，T细胞启动一套复杂的基因程序，导致细胞因子产生，细胞周期进程，和抗凋亡因子产生，最终导致T细胞增殖和功能分化。在启动抗肿瘤反应过程中，抗原受体和共刺激信号同样重要，许多治疗性疫苗结合（整合）抗原和树突状细胞或提高共刺激信号的试剂。
直到90年代中期才阐明T细胞的激活不仅启动T细胞反应程序，而且启动终止反应的负调控程序。主要的抑制程序通过CTLA-4介导，CTLA-4与CD28同源，也可与B7-1和B7-2结合，但较CD28的亲和力更高。T细胞活化后CTLA-4基因表达，进入并聚集于免疫突触内，最终通过竞争性结合B7减弱或干扰CD28共刺激信号，启动负调节信号。敲除CTLA-4的小鼠淋巴结肿大快速且致命的事实说明了CTLA-4在限制T细胞过度反应避免损伤正常组织的过程中有负性调节的作用。
所以，由于抗原受体信号和CD28共刺激分子所致的T细胞活化，不仅启动增殖和功能分化的基因程序，而且启动CTLA-4介导的抑制性程序，最后终止增殖。将这个模式应用到抗肿瘤T细胞反应中，重要的是，这也表明在这个程序启动后，疫苗常常刺激抗原受体信号实际上由于另外通过抗原受体信号诱导CTLA-4表达而强化了“关闭”信号。无论如何，这表明T细胞从活化到释放对于肿瘤免疫治疗转化策略的重要性。
刹车失活加强抗肿瘤免疫在90年代末期已经在体外观察到CD28和CTLA-4对T细胞反应的作用是相反的，在小鼠肿瘤模型，阻断抗体与CD28结合减弱抗肿瘤反应，阻断抗体与CTLA-4结合加强抗肿瘤反应。实际上，抗CTLA-4抗体单独治疗荷瘤小鼠，获得肿瘤完全消退和长期免疫。后来，对于机理研究揭示抗肿瘤活性与CD4和CD8效应细胞与FoxP3+的比值升高有关。在起初这些研究中，CTLA-4成功阻断提出了可信的两点：第一，由于靶分子在T细胞上而非肿瘤细胞上，可以想象相同的机制作用于不同组织的肿瘤和通过不同基因突变所致的肿瘤。第二，考虑到CTLA-4通过细胞内机制抑制CD28介导的共刺激信号，这样的抑制增强了T细胞共刺激，反过来可增强肿瘤疫苗的效力，同时也可加强在促炎性反应的情况下杀死肿瘤细胞的药物的效力。这些可能性进一步被一系列的不同鼠模型试验的结果所验证，包括验证了CTLA-4抑制不仅局限于任何特定肿瘤而是具有广泛的效应。CTLA-4也可以与表达细胞因子GM-CSF肿瘤细胞疫苗协同杀死肿瘤。最后，CTLA-4可联合局部放射，冷冻消融或荣肿瘤病*诱导系统的肿瘤免疫，进而消灭远处转移灶。这些临床前的研究支持着临床抗CTLA-4治疗的发展。
免疫检测点治疗：临床疗效通过完全人源化抗体（ipilimumab）阻断CTLA-4，将其应用于临床。在不同肿瘤治疗的I/II期临床试验中观察到肿瘤缩小，包括黑色素瘤，肾细胞癌，前列腺癌，尿路上皮癌和卵巢癌。Ipilimumab的两个前列腺的III期临床试验近期已结束，第一个试验的去势抵抗前列腺癌的患者未接受前期化疗，第二个试验多数是晚期患者，其中去势抵抗前列腺癌患者化疗后疾病进展。第一试验尚待报道，第二个试验报道对于接受Ipilimumab治疗患者的生存获益缺乏统计学意义（P=0.）。然而亚组分析提示那些较好的临床特征如无肝转移的患者从Ipilimumab治疗中获益。两个抗-CTLA-4（Ipilimumab）治疗黑色素瘤的临床试验证明了总生存期的延长。重要的是，这些临床试验提示高于20%的治疗患者长期持续缓解，存活超过4年，其中近期分析提示一部分患者存活超过10年或更长。于年FDA批准Ipilimumab治疗黑色素瘤患者。
抗CTLA-4在临床上的成功开辟了新领域，将“免疫检测点”的视为T细胞内在途径被识别，并被作为临床靶点。另一个继CTLA-4被发现的T细胞内抑制通路是通过PD-1（程序性死亡1）和它的配体PDL-1介导。PD-1最初是在年对于胸腺通过程序性细胞死亡负性选择T细胞的分子研究中被克隆的。直到它的配体被发现后，PD-1作为免疫检测点的功能才被明确。PD-1通过诱导T细胞凋亡而保护肿瘤细胞。后来，在动物模型临床前试验对抗PD-1和抗PDL-1抗体作为免疫检测点治疗进行评价。
与CTLA-4基本相同，PD-1仅表达于T细胞，与CTLA-4不同的是，PD-1并不与CD28竞争性结合B7，是而是通过干扰T细胞受体信号，进而抑制T细胞反应。PD-1也有两个配体，PDL-1和PDL-2。PDL-2主要表达与APCs，而PDL-1可表达与许多细胞，包括组成免疫系统的细胞，上皮细胞和内皮细胞。靶向PDL-1的抗体已在多种肿瘤的治疗中获得临床效果，包括黑色素瘤，肾细胞癌，非小细胞肺癌和膀胱癌。类似的，抗PD-1的单克隆抗体的I期临床试验证明在多种肿瘤治疗中获得临床获益，包括黑色素瘤，肾细胞癌，非小细胞肺癌，霍奇金淋巴瘤和头颈部肿瘤。最近，一个关于抗PD-1抗体，MK-的大型I期临床试验，证实晚期黑色素瘤患者的反应率为37-38%，其中包括Ipilimumab治疗后疾病进展的患者，这使得年9月MK-（pembroluzimab）通过了FDA的审批。抗PD-1抗体（nivolumab）治疗转移性黑色素瘤的III期临床试验，也得到较化疗高的反应率和总体生存的结果（Robert）。年11月nivolumab被FDA批准用于转移性黑色素瘤的治疗。基于与多西紫杉醇单药化疗相比nivolumab延长晚期转移非小细胞肺癌患者总生存期的III期临床试验结果，于年3月nivolumab被FDA批准用于治疗后的晚期或转移性非小细胞肺癌。
由于CTLA-4和PD-1调节T细胞不同的抑制途径，两分子靶向抗体的联合治疗在临床前鼠模型中进行了试验，并得到了良好的抗肿瘤效果。最近，抗CTLA-4联合抗PD-1治疗晚期黑色素瘤的I期临床试验报道50%的患者肿瘤缩小，大部分患者的肿瘤缩小达到80%或以上。有些抗CTLA-4（Ipilimumab）联合抗PD-1或抗PDL-1治疗其他肿瘤的临床试验正在进行中，早期数据显示较好的疗效，使得联合治疗作为肿瘤患者有效的免疫治疗策略得到