方奕鹏，柴彦，张会娟，郭喆，王仲
作者单位：清华大学临床医学院
清华大学医院
引用文本：方奕鹏，柴彦，张会娟，郭喆，王仲.青蒿素及其衍生物防治细胞因子风暴的相关机制与潜在应用价值[J].中国急救医学,,41(4):-.
细胞因子风暴是指机体出现不可控制的、过度的炎症反应的病理现象，其核心机制是机体免疫调控失衡继而出现的体内促炎症反应因子的大量释放。这种现象可出现在多种疾病发展过程中，如脓*症、急性呼吸窘迫综合征、急性胰腺炎、创伤等。由于细胞因子风暴的产生，机体可在短时间内从局部或者单一脏器的病变快速序贯性出现邻近甚至远隔的脏器损伤，最终发展成为多脏器功能不全(MODS)，甚至死亡。调控免疫失衡及抑制过度的炎症反应是改善炎症失衡，防治细胞因子风暴及相关疾病的手段之一。
青蒿素是一种从中草药青蒿中提取出来的有效成分，因具备良好的抗疟疾疗效，并且副作用小，已成为目前抗疟疾治疗的一线用药。青蒿的使用最早可追溯到东晋时期，名医葛洪在《肘后备急方》中记录了利用青蒿治疗疟疾的方法。中国中医科学院屠呦呦团队也因其在青蒿素提取工作中作出的贡献，获得年诺贝尔生理学及医学奖。除了青蒿素，近年来也逐渐发现了青蒿素的衍生物，包括蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯、双氢青蒿素、SM、SM、SM、SM、Di-ART-GCP、DC32等。随着对青蒿素及其衍生物研究的逐渐深入，其在抗炎、免疫调节等方面的效能被逐渐发现，并被证实在多种疾病模型中具有良好作用。本文以青蒿素及其衍生物的抗炎及免疫调控方面的药效为核心，对近年来报导的青蒿素及其衍生物抗炎免疫调控作用及相关疾病模型研究进行总结。
一、抗炎及免疫调节作用01青蒿素及其衍生物的抗炎作用众多文献报道，青蒿素及其衍生物可以调控多种炎症介质，包括降低促炎症介质肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-6、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1及提高抗炎症介质IL-4、IL-10等的水平。其抗炎作用与多条炎症相关信号通路密切相关。见表1、图1。
02青蒿素及其衍生物的免疫调控作用1参与固有免疫系统的调控
巨噬细胞和树突状细胞(dendriticcells，DCs)是人体固有免疫系统的主要成员，前者可依据周边微环境的差异表现出不同的表型，后者具备强大的抗原提呈功能。在实验性肠病模型中证实，青蒿琥酯对免疫的调节以先天性免疫为主要靶点，可作用于巨噬细胞和DCs，其单独或联合免疫调节剂使用均表现出良好的抗炎效应。青蒿琥酯以时间依赖方式经半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-9途径有效诱导腹腔原代巨噬细胞和骨髓来源原代DCs的凋亡，同时降低DCs分泌IL-12和巨噬细胞分泌TNF-α的能力，减轻机体炎症反应，抑制核转录因子(NF)-кB信号通路的活性，从而降低巨噬细胞释放TNF-α的水平，是青蒿素及其衍生物抗炎的经典途径。RAW.7细胞模型中，青蒿琥酯还可通过TRAF6-Beclin1-PI3KC3信号通路来抑制巨噬细胞自噬的激活，减少TNF-α及IL-6释放。此外，有进一步研究发现，青蒿素及其衍生物减少巨噬细胞释放IL-1B、IL-6、IL-8等的作用亦与NF-кB信号通路密切相关，丝裂原活化蛋白激酶(MPAK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT、Toll样受体(TLR)、细胞内核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(Nod2)等多条经典炎症信号分子亦参与到青蒿素及其衍生物抑制单核-巨噬细胞分泌促炎症介质的调控中(图1)。除抑制促炎症介质的产生外，青蒿素及其衍生物还可以诱导抗炎症细胞因子的产生，如IL-10而发挥抗炎作用。众所周知，巨噬细胞是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁，可通过吞噬、内化及抗原提呈途径而激活获得性免疫。因此，对于巨噬细胞的调控常常影响获得性免疫系统的功能。例如，相关研究证据表明，在T细胞分泌的IFN-γ刺激下，巨噬细胞及巨噬细胞样成纤维细胞被激活并产生各种介质，包括基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)和一氧化氮(nitricoxide，NO)，并加重组织损伤，或通过分泌IL-12/IL-23形成正反馈回路，而使辅助性T细胞(Th)1/Th17反应增强。上述依据表明，青蒿素及其衍生物能够抑制巨噬细胞和DCs的活化，调控巨噬细胞及DCs的数量及功能水平，进而参与炎症调控，且这种作用亦可能对获得性免疫系统产生影响。
2参与获得性免疫系统的调控
获得性免疫系统，包括细胞免疫及体液免疫系统的失衡是细胞因子相关性疾病发生的另一重要机制。青蒿素及其衍生物亦被明确证实参与了细胞免疫及体液免疫的调控，但目前相关证据主要是基于慢性炎症性疾病研究所获得的。
1细胞免疫系统的调控现有证据支持青蒿素及其衍生物在维持Th、调节性T细胞(regulateTcell，Treg)滤泡辅助性T细胞(follicularhelperTcells，Tfh)和滤泡调节性T细胞(Tfollicularregulatorycells，Tfr)的表达及亚型占比等方面发挥了积极作用。
首先，青蒿素及其衍生物可有效抑制T细胞活化水平，通过抑制Th1、Th17并增强Th2的功能及表达水平，维持正常Th水平及各亚群占比，通过影响Th释放细胞因子过程，从而对免疫功能及炎症水平起到调控作用。其次，青蒿素及其衍生物参与Treg水平及功能调控。在早期阶段，蒿甲醚被证实在有效限制T细胞增殖的同时，降低体内IL-2水平，从而导致Treg功能受限。但现阶段已有多种衍生物，包括SM、青蒿琥酯、双氢青蒿素可明显提高Treg表达水平，改善Treg/Th17失衡。第三，青蒿素及其衍生物参与Tfh，Tfr水平及比例的调控。二者参与调节B细胞功能，对GC形成、抗体的亲和力成熟和记忆B细胞的产生都是必不可少的，而两者比例的失衡(Tfh增高或Tfr降低)，与自身免疫性疾病病态抗体的过度分泌相关，可促进疾病的进展。目前，关于青蒿琥酯对Tfh及Tfr调控作用研究结果并不一致。在系统性红斑狼疮(SLE)模型中证实，青蒿琥酯有效降低SLE小鼠脾脏内的Tfh水平，提高Tfr水平，维持Tfr/Tfh比例，减轻SLE程度并延长生存时间。而另一研究发现，青蒿琥酯调控GCB细胞而不影响Tfh水平。SM不影响GCB细胞比例，但被证实可通过限制Tfh和Th17的分化而发挥抑制免疫的作用。
2体液免疫系统的调控青蒿素及其衍生物可抑制在多种病理状态下体内抗体的产生，这是其参与体液免疫调控的重要依据。迄今为止，青蒿素及其衍生物对B细胞的直接作用尚未有研究证实，目前更多的研究认为，抗体水平的降低是T细胞抑制的继发性改变。青蒿琥酯、双氢青蒿素、SM被证实可有效降低SLE小鼠血液中的抗核抗体(antinuclearantibodies，ANA)及双链DNA(double-strandedDNA，dsDNA)等病理性抗体水平。在类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)模型中发现，青蒿琥酯在参与B细胞功能调控时，通过抑制GCB细胞的增殖，限制GC的形成和自身抗体的产生，从而阻断RA的发生与进展。SM则可抑制TLR/MyD88/NF-кB信号通路从而抑制脾脏局部B细胞活化及浆细胞形成，降低两者在B细胞中所占比重，降低机体炎症水平。
二、青蒿素及其衍生物在相关疾病模型中的研究结果01脓*症(sepsis)1调控免疫与抗炎
口服青蒿琥酯可有效降低注射了致死量大肠埃希菌的脓*症小鼠病死率，改善程度可达90%。研究证实，青蒿琥酯可抑制RAW.7细胞分泌TNF-a、IL-6，并降低脓*症小鼠体内TNF-α、IL-6水平，有效抑制NF-кB通路活性，并下调TLR4和TLR9表达。青蒿琥酯这一抗炎作用在注射寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)、脂多糖(LPS)、热灭活或存活的大肠杆菌的脓*症模型中均被证实是有效的。在G+球菌感染的脓*症模型中，肌肉注射青蒿琥酯被证实可通过下调TLR2和Nod2的微小核糖核酸(mRNA)表达水平、抑制NF-кB信号通路活性的方式降低小鼠体内及腹腔原代巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6水平，从而明显降低注射了致命剂量金*色葡萄球菌小鼠的病死率。
2保护血管内皮屏障
血管内皮屏障功能受损可导致毛细血管渗漏，引起组织灌注不足、氧气弥散距离增大，进而影响脏器正常氧供。保护血管内皮屏障功能的完整是防治脓*症的有效手段。Cheng等发现，在LPS制造小鼠脓*症模型中，小鼠出现肾小球局部出血、水肿及炎症浸润，提示存在肾脏局部血管内皮高通透性改变，而双氢青蒿素干预可提高Occludin蛋白表达，改善内皮细胞间紧密连接，降低肾小球血管内皮通透性，从而有效改善肾损伤。
3调控细胞凋亡
在抗炎基础上，青蒿素及其衍生物可通过细胞自噬、凋亡调控而参与到脓*症防治中。Kuang等在RAW.7、小鼠腹腔原代巨噬细胞及小鼠骨髓原代单核细胞脓*症模型中发现，青蒿琥酯降低TNF-α、IL-6水平的效果可被自噬抑制剂所抵消，首次证实青蒿琥酯在脓*症模型中的抗炎作用与调控细胞自噬相关。该研究进一步发现，青蒿琥酯在缺乏TLR4或肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)-6低表达的巨噬细胞中亦无法发挥正常抗炎功效，从而证实其调控自噬的作用与TLR4/TRAF-6通路相关。青蒿琥酯抑制自噬的作用与阻断TRAF6-Beclin1-PI3KC3途径密切相关，该通路可通过减少Beclin1的K63连接泛素化，从而干扰TRAF6-Beclin1的相互作用，阻断PI3K-Ⅲ复合物的Beclin1-PI3KC3核心复合物形成，最终影响细胞自噬。Liu等经腹腔注射LPS构建脓*症小鼠模型，发现脓*症小鼠肾脏组织中凋亡细胸明显增多，目肾脏局部有更高的凋亡相关蛋白Apaf-1，cleaved-Caspase-3的表达，通过补充双氢青蒿素可有效降低肾脏局部凋亡细胞的比例及凋亡相关蛋白表达水平，并改善脓*症肾损伤程度，从而证实双氢青蒿素通过调控细胞凋亡参与到脓*症救治中。
4抗氧化应激
氧化应激作用是LPS介导脏器损伤的机制之一。脓*症急性肾损伤小鼠模型体内发现丙二醇(malonaldehyde，MDA)、NO等分子水平增高，伴有还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(orgolein，SOD)等抗氧化分子的活性降低，提示存在氧化应激损伤。通过补充双氢青蒿素可改善上述分子的表达，并最终降低小鼠血清中尿素氮、肌酐比值，保护肾脏功能。
5增强免疫细胞的内化作用
肝脏的Kupffer细胞对LPS的内化作用被证实是肝脏代谢LPS的首要步骤。Li等发现，青蒿琥酯具有保护脓*症小鼠肝细胞的功能，可提高脓*症小鼠体内的清道夫受体(seavengerreceptors，SRs)水平，从而增强外周及肝脏免疫细胞清除LPS的能力，达到降低小鼠体内LPS、炎症因子水平及整体病死率的目的。
6抗菌药物协同作用
虽然青蒿琥酯被证实并不具备直接抗菌、杀菌效应，但与抗菌药物联合使用却具备良好的协同效应。在G-及G+感染模型中均证实，相较于单独使用抗菌药物或青蒿琥酯，联合使用两者可进一步提高脓*症小鼠的存活率。针对耐甲氧西林金*色葡萄球菌(MRSA)感染脓*症模型，单独使用奥沙西林或青蒿琥酯均不具备保护MRSA感染小鼠的能力，而联合使用则可一定程度提高该类型小鼠的存活率，这与青蒿琥酯抑制青霉素结合蛋白2a(PBP2a)并下调mecAmRNA表达来增强β-内酰胺类抗菌素的抗菌活性密切相关。该发现提示，与青蒿素及其衍生物的联合使用，可能有助于提高抗菌药物的抗菌能力，未来可能成为临床治疗耐抗菌药物致病菌的新手段。
02急性呼吸窘迫综合征(ARDS)在两项基于肾脏缺血再灌注肺损伤的动物模型研究中发现，青蒿琥酯预处理可抑制血红素加氧酶(HO)-1信号分子及NLRP3炎性小体，有效降低小鼠血清及肺内IL-6、巨噬细胞炎症因子(MIP)-2和前列腺素E2(PGE2)等炎症介质和NO、MDA等氧化应激相关指标水平，从而改善动脉血气、生化指标、髓过氧化物酶(MPO)活性、肺脏干/湿比重，减轻肺泡炎症细胞浸润程度，减轻肺损伤程度。在脓*症相关肺损伤模型中，青蒿琥酯的抗氧化应激和抗炎作用亦被证实。Cao等发现，HO-1蛋白是青蒿酯保护脓*症肺功能的关键环节之一，15mg/kg的青蒿琥酯可增强Nrf2、HO-1信号分子的表达并降低体内炎性介质水平，达到降低CLP相关肺损伤小鼠的肺部损伤程度及整体病死率的效果。Zhao等在经气道内滴注LPS构建的小鼠肺损伤模型中发现，青蒿琥酯通过抗氧化应激及抗炎作用改善小鼠肺损伤，Nrf2、HO-1以及TLR4、NF-кB信号分子分别参与这两个重要环节的调控。双氢青蒿素是另一种能有效改善脓*症模型肺损伤的药物，Huang等经气道滴注LPS构建小鼠肺损伤模型并提取其原代腹腔巨噬细胞，发现补充双氢青蒿素可有效减轻模型的促炎症细胞因子水平，改善氧化应激相关指标及肺脏损伤程度，进一步证明这些作用与NF-кB通路的抑制相关，且均可被Nrf2的抑制剂ML部分抵消。上述结果提示，双氢青蒿素在脓*症中的肺保护作用与Nfr2信号分子密切相关。除了抗炎和抗氧化应激的药效外，青蒿素及其衍生物的抗纤维化在急性肺损伤(ALI)/ARDS治疗中亦扮演重要作用。博来霉素肺损伤模型研究中发现，双氢青蒿素可有效减少小鼠肺脏局部转化生长因子(TGF)-β1的产生和α-SMA的表达水平，减轻纤维化程度，其抗纤维化作用涉及：①抑制细支气管成纤维细胞的增殖；②抑制肺泡间隔的增厚以及肺泡损伤；③减少促炎症细胞因子TNF-α和NF-кB信号分子表达，减轻肺脏局部炎性细胞的浸润：④抑制纤维化细胞因子的产生；⑤抑制Nrf2/HO-1，降低MDA并提高SOD、GSH水平，抑制氧化应激反应。一项评估青蒿琥酯在百草枯相关肺损伤研究中证实，青蒿琥酯有效降低IL-10，TNF-α及TGF-β1的水平并减轻肺损伤程度。但上述研究对肺纤维化的评估仅仅局限于血液化验及组织病理学水平，未从肺功能角度对药物的抗纤维化疗效进行评估，其功能学上的疗效有待进一步明确。
03急性胰腺炎(AP)AP发病过程中细胞因子的异常释放是其病情加重并造成MODS的重要因素。Zhao等设想通过增加胰腺细胞凋亡、限制其肿瘤样变来抑制其释放细胞因子的能力，从而阻断重症胰腺炎和MODS发生。在雨蛙素诱导的AP动物模型研究发现，青蒿素有效提高AP小鼠胰腺细胞的凋亡水平，降低胰腺肿瘤样变细胞比例，同时伴有Caspase-3水平的调高，IL-1B、MIP-1α及NF-кB等分子水平的降低，最终达到减轻胰腺局部水肿、炎症浸润等组织学损伤的效果。另一项基于胆胰管逆行性注射牛磺胆酸钠诱导AP小鼠模型证实，青蒿琥酯可降低胰腺及血清中IL-1B、IL-6等促炎症细胞因子及TLR-4和NF-кB、p65等炎症相关信号分子的表达水平，降低小鼠血清中胰酶活性并减轻胰腺水肿、出血、坏死及炎症浸润等异常组织学变化，提高重型AP小鼠的存活率。
三、总结与展望越来越多临床现象和研究表明，免疫调控异常及细胞因子失衡是MODS发生的重要影响因素。青蒿素家族药物、青蒿素及其衍生物具有良好的免疫调控及抗炎作用，对巨噬细胞表型转化、T细胞活化、辅助性T细胞亚型转化、调节性T细胞生成、B细胞功能及生发中心的形成均有影响，参与了免疫系统多个组分的调控，对细胞因子分泌产生影响。除此以外，青蒿素及其衍生物在抗氧化应激、细胞屏障保护、调控细胞凋亡等方面具有丰富的药理作用，使其从多维度参与到相关疾病的防治中。更为特别的是，青蒿素类药物容易获取、经济实惠、副作用少，若能进一步证实其在阻断细胞因子风暴方面具有确实可行的干预作用，将对脓*症的预防与阻断、急性重症胰腺炎的防控及其他炎症因子风暴造成的MODS诊治带来巨大影响。但现有的研究材料均以细胞及动物实验为基础，结论是否证实适用于人体有待进一步探索。总之，基于目前的研究结论，青蒿素及其衍生物具备成为细胞因子风暴防治的新手段，值得进一步深人研究。
多点