10July
胰腺癌(Pancreaticadenocarcinoma)是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，其发病率与死亡率几乎相当。早期诊断困难与缺乏有效的个体化治疗方案是导致胰腺癌预后极差的重要原因，80%左右患者确诊时已发生肿瘤外周侵犯或远处转移，无法接受手术治疗。随着“精准医学”的概念被逐渐运用至肿瘤领域中，以高通量捕获测序为基础的ctDNA检测因其能够无创、实时、全面地揭示全身多病灶突变信息成为了目前肿瘤精准诊疗的焦点。
本文总结了ctDNA/cfDNA的相关信息及刘宵宇、王小林、仇子龙、楼文晖教授科研团队对于胰腺癌ctDNA检测研究的突破性进展。
◆◆ctDNA应用潜力◆◆研究表明，ctDNA可能来自凋亡细胞，因此其可能代表肿瘤细胞的特定亚型。但也有研究认为，ctDNA提供了肿瘤基因组的全景视图，因为它反映了从多个肿瘤区域或不同肿瘤病灶释放的DNA信息，对ctDNA的分析可以发现组织活检中无法发现的体细胞突变。
随着测序技术的发展，如今的深度测序已经能够满足评估肿瘤内异质性和亚克隆突变的需求，并且能够揭示具有不同基因组特征的特定分子亚型。
ctDNA因具有以下优点而能够成为精准肿瘤学的潜力标志物(图1)：
提供对肿瘤基因组的综合描述；
深度测序可以发现肿瘤内异质性和只在部分细胞中出现的基因突变；
与CTC相比，ctDNA作为生物标志物的优势在于它可能提供有关肿瘤大小的信息，从而反映出疾病的发展状态和对疗法的反应；
具备预测预后的价值；
能够发现肿瘤抗性；
提供对肿瘤基因组的综合描述等。
图1.ctDNA作为精准肿瘤标志物的潜力。
◆◆ctDNA应用难点◆◆目前公布的ctDNA检测数据主要集中在主流癌种，如肺癌和结直肠癌，而针对发病率偏低的癌症类型其研究相对较少。另，作为检测金标准的肿瘤组织，临床上也面临着ctDNA与组织一致性的比较，它们有各自的特点(表1)。
表1组织活检与ctDNA检测特点对比
*：解卷积（Deconvolution），是指从异构样本中提取细胞类型特异性信息的过程。在液体活活检中，这可能涉及将血浆DNA片段分解成其构成要素（例如，基于甲基化标志物确定其组织起源）。
ctDNA的检测另难点之一是：血液中的ctDNA通常在数量上远远少于非癌cfDNA，因此分析ctDNA时的瓶颈问题在于如何从正常细胞cfDNA背景下检测到罕见的ctDNA片段。
ctDNA具有高度碎片化的特点，在血液中是以裸露核酸的形式存在，这也从另一个侧面提示它们可能源于凋亡进程中核小体所含的核酸片段。研究表明，cfDNA的半衰期仅有1~2个小时，在外周血中处于一个动态的不断变化的过程，其表达量取决于产生cfDNA的来源。血浆中总cfDNA含量低，且ctDNA仅为cfDNA中很小的一部分，虽然ctDNA在cfDNA中的占比波动范围非常大，但实际上大多数ctDNA在cfDNA中的占比~0.2%。
在检测中一般是通过进一步提高分析灵敏度来解决上述问题。临床实践中的解决方法之一是通过显着增加样本体积（即采集肿瘤患者更多的血液）来增加可检测分子的数量，但这种方法在晚期疾病患者中通常不具有临床可行性；或者通过大量血浆样本突变检测来确定被定义为肿瘤突变阳性所需的最小检测突变数，从而弥补ctDNA的低起始量。解决ctDNA低起始量的最新技术发展集中于提高测序方法的分析灵敏度上，但这可能受到血浆cfDNA提取、测序文库制备、测序过程中引入错误等影响。其他增加分析灵敏度的尝试集中在基于ctDNA/cfDNA的长度来富集ctDNA片段。
◆◆ctDNA检测方法◆◆cfDNA的检测方法有很多，根据检测原理的不同可分为4类：
基于实时荧光定量PCR的技术；
基于数字PCR（dPCR）的技术；
基于飞行质谱（MS）的技术；
基于高通量测序（NGS）的技术。
它们有各自的优缺点(表2)。
表2cfDNA检测技术比较
基于qPCR技术的cfDNA检测因简单、快速、部分方法灵敏度高、检测成本相对较低而应用广泛，目前FDA和欧洲药监局已经批准2种基于ARMS对血浆中EGFR突变进行检测的qPCR方法（CobasEGFRMutationTestv2和TherascreenEGFRRGQPCRKit），但qPCR技术在大规模临床试验的进一步推广还需验证。
与传统的qPCR相比，dPCR因不受扩增曲线Ct值、内参、标准品或标准曲线等因素的影响而具有更高的准确度、灵敏度和重复性，其检测极限可达0.%。
qPCR和dPCR在通量上都不及飞行质谱和NGS。飞行质谱已经广泛应用于核酸检测领域，如SNPs(单核苷酸多态性)、产前诊断、DNA甲基化分析、基因表达等。
但由于技术限制，ddPCR很难检测短核苷酸链上的基因突变，且无法在基因组层次上对ctDNA进行大规模测序，使得ddPCR技术无法宏观描绘ctDNA突变的基因组图谱，在一定程度上限制了ddPCR的应用前景。NGS可以在基因组水平检测ctDNA携带的突变，但目前NGS方法检测ctDNA突变的灵敏度和特异性还有待进一步提高，受到建库方法和测序深度的影响比较大；尤其是超深度测序时，NGS检测ctDNA的成本较高。
◆◆ctDNA检测新突破◆◆年3月9日，中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所仇子龙研究员联合医院介入治疗科王小林教授课题组、胰腺外科楼文晖教授团队近日在EBiomedicine上合作发表题为《通过富集短片段cfDNA提高胰腺癌的检出》（Enrichmentofshortmutantcell-freeDNAfragmentsenhanceddetectionofpancreaticcance）的研究论文，提出了基于单链建库的cfDNA建库和测序方法，该方法较传统的二代测序和ddPCR技术，能使早期胰腺癌患者血液中的ras突变的检出率从不足50%提升至70%左右，显著提高了早期胰腺癌患者循环肿瘤DNA即ctDNA突变的检出率，以达到疾病的早期诊断和监测的目的。
该研究建立了一种ssDNA建库进行cfDNA测序的新方法（single-strandlibrarypreparationandhybrid-capture-basedcfDNAsequencing，SLHC-seq），并验证了在极低总样本量的情况下，ssDNA建库测序检测和定量基因组中超低丰度突变的效能远高于目前常用的基于双链的建库方法。研究者收集不同分期的胰腺癌患者，评估了这些患者外周cfDNA的浓度，并通过ssDNA方法鉴定了胰腺癌ctDNA的突变图谱。
研究描述了一种单链库制备法，用于临床队列中PC和健康对照者的游离DNA(cfDNA)测序。cfDNA分析的一个主要缺陷是高分子量基因组DNA的污染，它是在提取血液并离心提取血浆时从健康的血细胞中产生的。SLHC-seq法富集降解ctDNA的cfDNA短片段，对去除污染的高分子量基因组DNA具有重要意义。本研究意义在于，这种单链文库制备方法比传统的测序和PCR方法敏感得多。此外，该方法也可应用于石蜡包埋的组织标本、胰液或囊肿液等非液体活检标本，这些标本在DNA降解、数量少、质量低等方面与液体活检标本有相似的缺陷。与其他使用液体活检的肿瘤突变检测方法相比，该方法检测突变的效率更高。当肿瘤cfDNA水平较低时，如早期疾病或症状前疾病时，这一点尤为重要。
胰腺癌起病隐匿，早期就已是全身疾病。胰腺癌存在的KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4体细胞突变，可作为肿瘤cfDNA的特异性标志物，用于检测这些患者的播散性或残留性疾病。本研究还发现早期患者中普遍存在小突变片段，这可能是一种基于片段大小的胰腺癌早期检测策略。这对于家族性胰腺癌、可疑胰腺病变和晚发性糖尿病患者等高危人群的早期检测具有重要意义。
卡哈尔研究所JulieEarl教授在述评中高度评价了该研究，指出该研究所述的方法也适用于其他类型的需要液体活检的肿瘤。此外，深化了对液体活检样本的cfDNA的高效、有效地测序提供了新的思路；并认为该技术该研究具有很强的向临床转化的可能，这无疑将对肿瘤患者的临床诊疗产生积极的影响，并为预后不良的胰腺和其他肿瘤类型提供更加个性化的治疗方法。
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责任编辑：Zelin
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