撰文丨十一月
责编丨酶美
科学研究从筛选出发将会系统性、大规模地为某个生物问题给出答案。当营养物质丰足时，哺乳动物细胞通过质膜转运输入单体氨基酸，满足自身对于外源氨基酸的需求。但是当营养物质不丰富时，大多数细胞外空间所包含的蛋白质可以通过细胞的内吞作用以及溶酶体的分解代谢在细胞内分解为氨基酸。大胞饮作用（Macropinocytosis）以及溶酶体分解构成了新的氨基酸来源，这两种信号通路在癌症细胞中通常会出现活性增加的现象，帮助恶性肿瘤细胞在不良环境中生长。营养环境深刻地影响哺乳动物细胞的活性和特征。但支持细胞使用细胞外蛋白质作为营养物质的分子途径仍然不完全清楚。
为此，德国癌症研究中心WilhelmPalm研究组、奥地利维也纳生物中心JohannesZuber研究组合作在Science发文题为LysosomalenzymetraffickingfactorLYSETenablesnutritionalusageofextracellularproteins，于此同时美国斯坦福大学JanE.Carette研究组与德国汉堡埃本多夫大学医学中心ThomasBraulke研究组合作背靠背发文题为ThehumandiseasegeneLYSETisessentialforlysosomalenzymetransportandviralinfection。两篇文章分别从不同的表型入手，通过大规模CRISPR筛选确定了位于高尔基体的TMEM/LYSET跨膜蛋白作为溶酶体酶运输途径的核心成分，对溶酶体生理学功能、细胞外蛋白质营养利用、肿瘤代谢、新冠病*感染等过程发挥着关键作用。
为了找到摄取细胞外蛋白质作为影响物质的关键调控因子，作者们尝试建立不同的筛选条件。作为初步筛选的模型，作者们选择了MIAPaCa-2胰腺癌细胞，该细胞系是一种营养缺乏的细胞类型，细胞外蛋白质是它们重要的氨基酸来源。为了在营养匮乏开始时启动基因编辑，作者们设计了一个单细胞来源的MIAPaCa-2克隆，该克隆中包含多西环素诱导的iCas9。该细胞系不显示基础的Cas9活性，但在加入多西环素后会迅速触发CRISPR编辑，并使用白蛋白作为亮氨酸来源进行稳定增殖（图1）。然后作者们对MIAPaCa-2iCas9细胞使用全基因组sgRNA文库转导，在Cas9诱导以及不同培养基条件下进行培养。通过筛选，作者们发现对于溶酶体运输、氨基酸转运以及氨基酸敏感的mTORC1以及GCN2-ATF4信号通路的成分增加，证明该筛选的确能够发现与影响代谢相关变化。这些靶蛋白中，跨膜蛋白TMEM引发了作者们的兴趣，后文称为溶酶体酶转运因子LYSET。
图1溶酶体酶运输因子筛选方案
随后为了验证LYSET对于细胞利用细胞外蛋白质的关键作用，作者们构建了诱导敲除LYSET的胰腺癌细胞系。LYSET敲除的细胞在标准培养基下能够正常生长，但是在缺乏亮氨酸进行胞外白蛋白补充的培养基中无法增殖。进一步地，作者们在多种不同的癌症细胞系、成纤维细胞系、肾脏细胞系中进行了LYSET的删除，发现在标准培养基条件下，LYSET的缺失对细胞系的增殖没有显著影响，但是在亮氨酸缺乏的培养基中则强烈抑制了所有癌症细胞系的增殖和活力。因此，在营养丰富的条件下，LYSET对细胞活力和生长并不关键，但当细胞外蛋白质是必需的营养物质时，LYSET则被选择性需要。
为了确定细胞外蛋白质的营养利用过程中需要LYSET的亚细胞定位，作者们探索了在大胞细胞作用、内体运输和溶酶体分解代谢中的可能功能。作者们发现LYSET缺失导致自噬体蛋白p62和LC3-II的强烈积累。溶酶体通过各种水解酶的作用分解生物大分子，在LYSET缺陷细胞中，溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B和L的酶活性被强烈降低。因此，在LYSET敲除后，大胞饮作用和自噬性货物降解失败是由溶酶体酶活性的丧失引起的。
进一步地，为了揭开溶酶体分解代谢需要LYSET的原因，作者们使用液相色谱-质谱以及无标签定量比较野生型以及LYSET敲除后细胞的蛋白质组变化，LYSET缺陷的细胞中有6%的蛋白发生了显著的变化。LYSET缺陷细胞表现出溶酶体酶和其他溶酶体管腔蛋白的全局下降。通过对溶酶体内定位的分析，作者们发现在没有LYSET的情况下，大多数通常通往溶酶体腔的蛋白质都错误地转移到了细胞外空间。大多数新合成的溶酶体酶到达高尔基体后，通过GNPT和M6P（Mannose-6-phosphate）修饰酶的连续作用在溶酶体酶上加入M6P修饰，作为M6P受体的溶酶体运输信号。LYSET的丢失导致细胞中M6P修饰蛋白的大量减少，说明LYSET是溶酶体酶运输过程中M6P信号通路的关键组分。
随后作者们的工作证明了LYSET的缺陷会导致出现溶酶体相关疾病表型，也会导致GNPT磷酸转移酶从高尔基体到溶酶体的定位错误。因此，LYSET是M6P转运机制正常运作所必需的，LYSET的突变可以解释相关疾病的表型。
总的来说，两篇背靠背工作通过大规模的CRISPR-Cas9为基础的筛选发现了溶酶体酶运输因子LYSET。该因子是M6P途径的核心成分，也是溶酶体酶转运所必需的。这一发现为溶酶体生理学功能、细胞外蛋白质营养利用、肿瘤代谢以及溶酶体代谢疾病提供了科学研究以及药物开发的新方向。
两篇Science文章在线后第二周，密歇根大学李明课题组在NatureCommunications发表了TMEM/LYSET/GCAF的研究论文GCAF(TMEM)regulateslysosomebiogenesisbyactivatingthemannose-6-phosphatepathway。他们从溶酶体活性表型筛选入手，找到了TMEM基因，命名为GCAF，详见BioArt今日单独推送。
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