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董晨（中国科学院院士）、田志刚（中国工程院院士）
#肿瘤#
CD8+T细胞耗竭是机体免疫系统不能有效清除慢性病毒感染及恶性肿瘤的关键原因。相较于急性感染或者疫苗免疫情形下诱导形成的记忆性CD8+T细胞，耗竭的CD8+T细胞表面持续表达包括PD-1在内的免疫检查点分子，其增殖潜力、效应及杀伤功能等都较为低下，且易于凋亡。耗竭T细胞在领域内也一度被称为“僵尸”(Zombie)细胞。
通过单克隆抗体阻断PD-1介导的抑制性信号，可以在一定程度上逆转CD8+T细胞耗竭，促进病毒清除或控制肿瘤进展，构成了PD-1免疫检查点阻断疗法（Immunecheckpointblockade,ICB）临床应用的基础。目前，尽管该疗法在系列癌症治疗中取得了较好的效果，但仍然面临很大的挑战：首先，一些恶性程度较高的癌肿，如胰腺癌、脑胶质瘤、三阴性乳腺癌等，几乎不响应ICB；即使在响应的肿瘤类型里，病人的总体响应率较低（约20%-30%）；并且，在开始响应的病人里，治疗后期大多会出现耐药抵抗，只有极少数病人可长期获益并临床治愈。尽管如此，相比于靶向其它免疫检查点分子或抑制性信号，PD-1ICB仍显现出最优疗效。可以预测，在目前及未来一段时间，PD-1ICB仍将是肿瘤免疫治疗的重要基石，而进一步提升PD-1ICB的响应人群及临床治愈潜力则在很大程度上将依赖于对PD-1ICB作用机制的更深入理解。
叶丽林团队及RafiAhmed，DiYu等研究团队在年分别独立发现,慢性病毒感染中，位于淋巴组织内的耗竭程度较低的CXCR5+TCF-1+Tim3-CD8+T细胞作为耗竭前体细胞（progenitorexhaustedTcell,Tpex），功能性响应PD-1ICB。Tpex的发现打破了将耗竭T细胞作为“Zombie”细胞的固有印象，并立即成为T细胞耗竭领域的研究热点，目前相关论文已超过篇。多项研究在实体瘤中也发现TCF-1+Tim3-CD8+T细胞对PD-1ICB应答的关键作用。后续更多的临床相关研究表明：此细胞亚群与PD-1ICB疗效相关。基于这些研究，领域内的普遍观点认为，位于肿瘤组织微环境（TME）内的Tpex细胞直接介导了PD-1ICB的抗肿瘤效应，但是此观点缺乏直接的实验性证据。并且，一个不可忽视的事实是，Tpex在TME的数目极低（频率仅约5%）。另外，新的研究表明，响应PD-1免疫检查点治疗的细胞来源于肿瘤组织外部新补充的CD8+T细胞克隆，其可能来自于PD-1ICB作用后的系统性的，而不是TME局部性的CD8+T细胞应答。厘清这些领域内的关键性分歧对深入理解恶性肿瘤情形下的PD-1ICB作用机制具有重要意义。
年10月7日，陆军军医大学全军免疫学研究所叶丽林团队与合作者中山大学中山医学院唐忠辉团医院孙倍成团队在Cell杂志发表了文章TheprimordialdifferentiationoftumorspecificmemoryCD8+TcellsasbonafideresponderstoPD-1/PD-L1blockadeindraininglymphnodes。该研究首次发现在肿瘤引流淋巴结中存在肿瘤抗原特异性的记忆CD8+T细胞，并证实了该群细胞在PD-1ICB治疗中的关键作用。
利用多种移植瘤及原位肿瘤诱导模型，他们首先检测了引流淋巴结内的肿瘤特异性CD8+T细胞，发现一定比例细胞高表达TCF-1，低表达PD-1,但不表达耗竭特异性的转录因子TOX。重要的是，该细胞群（TOX-PD-1loTCF-1+）严格符合经典免疫记忆特征：1.不依赖于抗原的长期存活；2.再次遇到抗原，迅速大幅扩增，并分化为功能性的效应细胞；3.提供长期的免疫保护。基于典型的记忆性特征和特殊组织定位，他们将其命名为肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆CD8+T细胞，即TdLN-TTSM(TumorDrainingLymphNodederivedTumorSpecificMemoryTcell)。
随后通过高通量测序分析，研究人员发现在单细胞层面，TdLN-TTSM细胞转录特征更接近经典记忆细胞，而与耗竭T细胞差异较大。进一步分析ATAC-seq数据分析也得到一致的结论。通过PCA分析可以看到，淋巴结来源的抗原特异性CD8+T细胞表观遗传修饰特征从应答第4天就已经建立，并与Tmem有很大程度的相似，但二者也具有各自特征性的染色质开放区域（图2）。另外，CD8+T细胞在进入耗竭状态后，其基因组会在耗竭相关分子区域的表观遗传层面发生一些不可逆的改变，称为表观遗传伤疤（epigeneticscarings）。通过分析TdLN-TTSM,TdLN-Tpex的ATAC-seq测序数据，发现肿瘤引流淋巴结及慢性病毒感染来源的Tpex细胞以及脱离慢性病毒感染环境的Tex细胞（RecoveryTex）均在Pdcd1、Tox等基因多个位点存在不同程度的染色质开放，然而这些位点在TdLN-TTSM细胞中处于关闭状态，进一步证明这一特定细胞亚群不是耗竭T细胞。
与该群细胞的记忆特性相一致，向荷瘤小鼠分别回输来源于肿瘤和引流淋巴结的抗原特异性CD8+T细胞，TdLN-TTSM细胞呈现出显著优于Tpex及Tex的抑制肿瘤能力。
进一步，在体内和体外实验中，TdLN-TTSM细胞在应对PD-1抗体处理时比TdLN-Tpex细胞表现出更强的应答表现。并且，通过一系列肿瘤移植实验和淋巴结切除实验，发现PD-1/PD-L1ICB处理后，肿瘤组织内扩增的抗原特异性CD8+T细胞主要来源于TdLN-TTSM，而不是肿瘤中已经浸润的、耗竭的Tex及Tpex细胞。并且，无论在PD-1/PD-L1ICB治疗前或治疗中，去除此细胞亚群均导致PD-L1阻断抗体介导的免疫治疗失效；而回输TdLN-TTSM细胞则可以恢复此作用，进一步验证了TdLN-TTSM是真正响应PD1ICB的细胞亚群。
总结这项研究，其创新性及对将来肿瘤免疫治疗研发的提示作用主要体现在以下几个方面：1.打破了在肿瘤负荷下，只存在耗竭T细胞，不存在肿瘤特异性记忆T细胞的传统概念；2.进一步完善了PD-1ICB的时空作用机制：即PD-1ICB先在引流淋巴结扩增、动员TdLN-TTSM细胞分化为耗竭前体细胞，再进入TME发挥作用，不同类型及状态的TME可能决定这些PD-1ICB动员过来的细胞发挥抗肿瘤作用的潜力（下图）。这一结论也提示，PD-1ICB与靶向TME的调节因子向结合，可能导致更好的协同抗肿瘤作用；3.对于需清扫淋巴结的肿瘤外科手术而言，清扫时可考虑从这些淋巴结中分选、扩增TTSM细胞，过继转输回术后病人，辅以免疫检查点治疗，可能会防止肿瘤术后复发或者转移；4.TdLN-TTSM细胞是相对于处于耗竭状态的TIL更优的抗肿瘤过继T细胞疗法。
该研究由陆军军医大学全军免疫学研究所叶丽林教授、许力凡副教授，中山大学中山医学院唐忠辉教医院孙倍成教授共同合作完成。第一作者为南方医科大学广东省免疫治疗与免疫调节重点实验室黄启钊副研究员、中山大学中山医学院吴霞研究员、陆军军医大学全军免疫学研究所王志明博士及南方医科大学博士生陈香宇。
叶丽林团队聚焦针对病毒感染及恶性肿瘤的T细胞应答的基础与转化研究，相关论著发表于Nature(),Cell(),NatureImmunology(,),NatureMedicine(),Immunity()及CellHostMicrobe()等。现拟招收肿瘤免疫研究方向的Co-PI及博士后，工作地点可选择重庆及北京（昌平国家实验室）。
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